1.氣泡
由于HPLC系統(tǒng)中氣泡的存在，會(huì)造成色譜圖上出現(xiàn)尖銳的噪聲峰，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成分析靈敏度下降；氣泡變大進(jìn)入流路或色譜柱時(shí)會(huì)使流動(dòng)相的流速變慢或不穩(wěn)定，使基線起伏。造成上述現(xiàn)象的主要原因有三條：一是流動(dòng)相溶液中往往因溶解有氧氣或混入了空氣而形成氣泡；二是系統(tǒng)開(kāi)始工作時(shí)未能將流路中的空氣驅(qū)趕干凈；三是在注入樣品時(shí)不注意混入了空氣。
為了避免這類(lèi)問(wèn)題的出現(xiàn)，HPLC實(shí)際分析過(guò)程中必須重視對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行脫氣處理；在HPLC系統(tǒng)開(kāi)始工作前，可以用注射器連接恒流泵的排空閥，抽入流動(dòng)相，將流路中的空氣驅(qū)趕干凈；在注入樣品前注意排出樣品注射器中的空氣。
2.柱溫
在操作HPLC時(shí)，色譜柱是在室溫環(huán)境下工作的。大多數(shù)的工作環(huán)境溫度是不斷變化的，溫度的差別就會(huì)引起較復(fù)雜的問(wèn)題。溫度的影響在所有的色譜分析方式中都是存在的，HPLC方法中的洗脫方式受溫度的影響。
等度洗脫時(shí)溫度會(huì)影響保留時(shí)間，當(dāng)溫度升高時(shí)所有的色譜峰都前移了，等度洗脫時(shí)一般溫度每升高１℃，保留時(shí)間會(huì)縮短（1~3）％。溫度變化對(duì)梯度洗脫和等度洗脫的影響趨勢(shì)是一樣的。溫度變化對(duì)梯度洗脫的影響要小于對(duì)等度洗脫的影響。即便如此，若梯度洗脫時(shí)不控制溫度的話，保留值一般也會(huì)有較大的變化。溫度變化還可能引起選擇性顯著變化。
正如柱子不能*平衡將導(dǎo)致保留時(shí)間的重現(xiàn)性差一樣，柱溫不平衡也會(huì)導(dǎo)致不理想的后果，這個(gè)問(wèn)題在峰寬上的影響尤其明顯。當(dāng)溫度變化時(shí)除了選擇性和保留時(shí)間的變化之外，峰寬也會(huì)發(fā)生變化。升高溫度通常會(huì)使理論塔板數(shù)升高，峰寬變窄，由于峰面積不變，峰越窄就會(huì)越高，因此升高溫度可以達(dá)到更小的檢測(cè)限。
柱子里的溫度變化也會(huì)影響峰形。當(dāng)流動(dòng)相和柱子之間的溫差增大時(shí)，由溫度不平衡而導(dǎo)致的峰變形就會(huì)加劇。
為了獲得一致的結(jié)果我們必須要控制柱溫，使用柱溫箱是的辦法。如果沒(méi)有柱溫箱，zui有效的辦法就是將色譜柱隔絕在一個(gè)溫度波動(dòng)zui小的地方。
3. 色譜柱污染
色譜柱污染會(huì)引起保留時(shí)間漂移。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過(guò)濾器，它可以過(guò)濾并吸附流動(dòng)相攜帶的任何物質(zhì)。污染源可能是：流動(dòng)相本身，流動(dòng)相容器，連接管、泵、進(jìn)樣器和儀器密封墊，以及樣品等。
樣品中如果存在色譜柱上保留很強(qiáng)的組分，就可能使保留時(shí)間漂移。通常樣品中的強(qiáng)保留組分具有較高的分子量，在此情況下，保留時(shí)間漂移的同時(shí)或其后會(huì)有反壓的增加。可以通過(guò)使用固相提取等樣品前處理方法來(lái)去除樣品基質(zhì)的影響。
避免色譜柱污染zui簡(jiǎn)單的方法是防患于未然。相比之下，找到問(wèn)題的所在并設(shè)計(jì)有效的清洗步驟以去除污染物要困難的多。通常使用在給定色譜條件下的強(qiáng)溶劑，但并非所有污染物都可以在流動(dòng)相中溶解。
使用保護(hù)柱是個(gè)非常有效的方法。反沖色譜柱僅是不得已時(shí)采用的辦法。
4.色譜柱平衡
如果我們觀察到保留時(shí)間漂移，首先應(yīng)考慮色譜柱是否已用流動(dòng)相*平衡。通常平衡需要10~20個(gè)柱體積的流動(dòng)相。但如果在流動(dòng)相中加入少量添加劑則需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)平衡色譜柱。需要柱子的充分平衡，然后才能對(duì)HPLC進(jìn)行檢定。
5.流動(dòng)相有機(jī)溶劑
HPLC分析總要求使用HPLC純的試劑，關(guān)鍵是兩點(diǎn)：純度高、紫外吸收小。純度高，是希望沒(méi)有雜質(zhì)干擾HPLC分析；不會(huì)有金屬離子損害純度為99.99%以上的高純度硅膠基質(zhì)。可以通過(guò)重蒸分析純?nèi)軇换驗(yàn)V膜過(guò)濾，并定期把前置的過(guò)濾頭取下，放稀硝酸里清洗，再用純水洗至中性。
流動(dòng)相有機(jī)溶劑可能影響HPLC的檢測(cè)限。
6.柱壓
柱壓過(guò)高是HPLC分析中常碰到的問(wèn)題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問(wèn)題。溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升，應(yīng)更換柱子入口篩板；泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對(duì)溶劑進(jìn)行脫氣處理；比例閥失效，應(yīng)更換比例閥；泵密封墊損壞，應(yīng)更換密封墊；系統(tǒng)檢漏，則找出漏點(diǎn)，密封即可。
HPLC分析中，在色譜柱正常，樣品靈敏度足夠，分析方法合適，色譜峰在出峰時(shí)間較短的條件下，峰形應(yīng)對(duì)稱(chēng)而尖銳。充分考慮到可能影響分析結(jié)果的因素，可以科學(xué)地進(jìn)行液相色譜儀的檢定。
點(diǎn)擊交流